快速檢測(cè)飼料中有害微生物的方法與設(shè)備

　　當(dāng)前，飼料安全問題已成為全球關(guān)注的重要議題，而有害微生物污染也成為飼料安全中的一項(xiàng)主要控制指標(biāo)。飼料廠有害微生物主要有有害細(xì)菌、霉菌、大腸菌群等，它們對(duì)飼養(yǎng)動(dòng)物和動(dòng)物源性食品危害很大。飼料生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中普遍存在有害物質(zhì)，包括有害微生物的交叉污染。要控制飼料原料、產(chǎn)品中有害微生物，首先必須要有能夠準(zhǔn)確快速的有害微生物撿測(cè)方法。經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法往往比較費(fèi)時(shí)，所以有害微生物快速檢測(cè)方法成為近年來的研究熱點(diǎn)。本文根據(jù)近年來國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的研究文獻(xiàn)，總結(jié)有害微生物快速檢測(cè)方法的研究進(jìn)展，供參考。

　　1 飼料中有害微生物快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展

　　1.1 生物傳感器技術(shù)

　　生物傳感器(biosensor)是指對(duì)生物物質(zhì)敏感并能將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的儀器;生物傳感器又分為：酶生物傳感器、微生物傳感器和免疫傳感器。它們具有成本低、體積小、靈敏度較高的優(yōu)點(diǎn);能從腐敗或者半腐敗的食品、飼料中得到實(shí)時(shí)而快速、多樣化的分析檢測(cè)結(jié)果。

　　張杰等利用生物素——親和素系統(tǒng)將分子馬達(dá)與探針連接構(gòu)建了F0F1——ATPase分子馬達(dá)生物傳感器，它能對(duì)副溶血性弧菌特異性識(shí)別，最低檢測(cè)限為1pg/反應(yīng)體系，對(duì)其致病性進(jìn)行快速診斷，無需熱循環(huán)反應(yīng)，檢測(cè)周期縮短，整個(gè)分析過程只需1h——2h，不需酶切及電泳等繁瑣操作。

　　張捷等通過生物素——親和素系統(tǒng)將特異性沙門氏菌特異性基因(invA，作為其目的基因片段)核酸探針連接在F0F1——ATPase的ε亞基上構(gòu)建生物傳感器;將待測(cè)樣品和陰性對(duì)照分別與生物傳感器結(jié)合后，比較其催化三磷酸腺苷(ATP)合成30min后的ATP產(chǎn)生量，依此對(duì)樣品中的沙門氏菌DNA進(jìn)行檢測(cè)。該方法對(duì)沙門氏菌DNA的檢測(cè)時(shí)間為1h，檢出限為10ng/ml。從分析樣本分離得到的30株細(xì)菌，利用分子馬達(dá)生物傳感器的檢測(cè)結(jié)果與PCR 檢測(cè)的結(jié)果一致。

　　Kim等為了提高傳感器對(duì)單增李斯特菌的分析檢測(cè)能力，設(shè)計(jì)了與實(shí)時(shí)的分析系統(tǒng)相連結(jié)的IMC模塊(immuno——magnetic concentration)。生物傳感器技術(shù)大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，可在數(shù)小時(shí)甚至數(shù)分鐘內(nèi)查出致病微生物，為微生物的快速檢測(cè)提供了一種有效的工具。但該法在預(yù)處理方面受到某些限制。

　　1.2 基因芯片技術(shù)

　　基因芯片技術(shù)是在生命科學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展的新型食源性檢測(cè)技術(shù)。該法把微電子光刻技術(shù)與DNA化學(xué)合成技術(shù)相結(jié)合，大大提高了基因芯片的探針密度，且試劑用量減少，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和批量化大規(guī)模生產(chǎn)，有很大的發(fā)展?jié)摿?。將基因芯片技術(shù)與其它技術(shù)結(jié)合起來，能達(dá)到更好的效果。

　　戈海澤等根據(jù)生物信息學(xué)技術(shù)以細(xì)菌16SrDNA和23SrDNA序列設(shè)計(jì)各細(xì)菌的特異型探針和引物，在基因芯片制備基礎(chǔ)上，通過對(duì)靶基因的擴(kuò)增、雜交和對(duì)雜交結(jié)果的分析，對(duì)常見腸道致病菌的檢測(cè)和鑒定效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)對(duì)臨床采集100份腹瀉患者糞便標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。在100份臨床糞便標(biāo)本中，采用基因芯片技術(shù)共檢出50份(50%)攜帶腸道致病菌;細(xì)菌培養(yǎng)鑒定出47份(47%)攜帶腸道致病菌，其中42份基因芯片與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果一致，準(zhǔn)確率為79.25%，與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。該該法具有高通量、高準(zhǔn)確性和高靈敏度，檢測(cè)時(shí)間短，可同時(shí)檢測(cè)多種有害微生物，可以作為臨床鑒定細(xì)菌的一個(gè)重要的方法。將廣泛應(yīng)用于食品飼料安全控制，突發(fā)性食品安全事件檢測(cè)，出入境檢驗(yàn)檢疫等，但檢測(cè)費(fèi)用昂貴。

　　1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

　　聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速和對(duì)標(biāo)本的純度要求低等優(yōu)勢(shì);不過檢測(cè)樣品較多時(shí)工作量大。在食品安全越來越嚴(yán)峻的形式下，許多科技工作者試圖多種檢測(cè)方法聯(lián)用，達(dá)到解決上述問題的目的。將多種檢測(cè)方法聯(lián)用，旨在彌補(bǔ)單一檢測(cè)方法的局限性。目前國(guó)際上研究的熱點(diǎn)有多重?zé)晒鈱?shí)時(shí)PCR檢測(cè)技術(shù)，兼具多重PCR和熒光實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)監(jiān)控PCR產(chǎn)物兩方面的優(yōu)點(diǎn)。

　　石建玲等根據(jù)幽門螺桿菌23SrDNA序列設(shè)計(jì)引物和探針，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系并進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，對(duì)2012——05——10收集的100份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)并同時(shí)應(yīng)用免疫組化及銀染方法進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)：檢測(cè)范圍寬，在107copies/l——102copies/l(指1l溶液里面DNA/RNA的拷貝數(shù)是多少個(gè))內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)為1;與多種細(xì)菌均無交叉反應(yīng)，特異性好;檢測(cè)時(shí)間短，整個(gè)PCR反應(yīng)過程僅需70min;并可在不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品批內(nèi)重復(fù)測(cè)定，對(duì)臨床其它消化道病原體不出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增曲線;實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有靈敏度和特異性高及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)外也有將酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定與PCR技術(shù)聯(lián)用建立有害微生物檢測(cè)方法的報(bào)道，有效的提高了有害微生物的檢出率。

　　1.4 生物阻抗法

　　生物阻抗法的原理是利用由微生物新陳代謝引起的培養(yǎng)基電學(xué)特性變化快速檢出樣品中微生物的含量。阻抗法具有能區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，而死細(xì)胞常常無致病性，保障食品與飼料安全的關(guān)鍵就是檢驗(yàn)活細(xì)胞的數(shù)量。陳江利用阻抗法檢測(cè)啤酒有害乳酸菌，630A培養(yǎng)基(奧地利SY——LAB公司)較適合于阻抗法，用E值作為阻抗值變化的判斷標(biāo)準(zhǔn)，與傳統(tǒng)培養(yǎng)基法檢測(cè)結(jié)果相比，阻抗法的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能夠?qū)z測(cè)時(shí)間縮短至72h。此法檢測(cè)速度很快，但只能確定污染程度。

　　1.5 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

　　蛋白質(zhì)芯片技術(shù)又稱蛋白質(zhì)(微)陣列，是指將已知的大量蛋白質(zhì)(如酶、抗原、抗體、受體、配體、細(xì)胞因子等)固定在經(jīng)化學(xué)修飾的固相載體(璃片、硅片等)上，在保留蛋白質(zhì)物化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，蛋白質(zhì)與載體表面結(jié)合，再用激光掃描系統(tǒng)或者電感耦合器件獲取相關(guān)圖像;然后用專門的計(jì)算機(jī)軟件分析圖像、定性定量結(jié)果。Howell等采用俗稱軟蝕刻的微接觸印刷技術(shù)(microcontact printing，CP)制作出了一種可以檢測(cè)大腸桿菌E。coli O157∶H7及鮭腎桿菌(renibacterium salmoninarum)的抗體微陣列，結(jié)果表明：此芯片與其他有害微生物的交叉反應(yīng)少， 檢出濃度為7×107cfu/ml，檢測(cè)時(shí)間是40min，是一種很有效的微生物檢測(cè)方法。

　　方珍建立了檢測(cè)E。coli O157∶H7的液相蛋白芯片方法。通過繪制檢測(cè)曲線，分別應(yīng)用該方法及H2O作溶解劑的液相芯片方法檢測(cè)實(shí)際牛肉樣品。比較該方法與細(xì)菌分離培養(yǎng)法的陽性檢出率，能檢出陽性的最低濃度為103cfu/ml(?菌后)，最低檢出限為100cfu/ml;與18種腸道菌無交叉反應(yīng)，特異性良好;3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，批間變異系數(shù)7.61，重復(fù)性良好;應(yīng)用該方法檢測(cè)牛肉樣品中人工添加細(xì)菌，能檢出陽性的最低濃度為0.5cfu/ml(增菌前);應(yīng)用該方法檢測(cè)154份實(shí)際牛肉樣品，檢出陽性樣品19份，而細(xì)菌培養(yǎng)法檢出陽性樣品16份。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種高特異性、高靈敏度、高通量、重復(fù)性好、應(yīng)用性強(qiáng)、適用范圍廣且微型化的分析技術(shù)，在生命科學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域有很好的發(fā)展前景，但同基因芯片技術(shù)一樣，檢測(cè)費(fèi)用高，發(fā)展還不成熟。

　　1.6 納米金標(biāo)記技術(shù)

　　納米金標(biāo)記技術(shù)是指直徑在1nm——100nm金的微小顆粒，具有高電子密度，介電特性和催化作用，可以與多種生物大分子結(jié)合，且不影響生物大分子的生物活性。近年來，基于納米金標(biāo)記的快速檢測(cè)研究在有害微生物方面應(yīng)用比較多，檢測(cè)的微生物種類也比較多，國(guó)內(nèi)外科技工作者通過對(duì)納米金顆粒表面特性的處理以及在納米金顆粒表面標(biāo)記上特定的寡核苷酸探針，開發(fā)研究出了新的微生物檢測(cè)系統(tǒng)。

　　劉霞利用氨基偶聯(lián)法在傳感器表面固定多克隆抗體(PAb)作為一抗，金納米粒子(AuNPs)標(biāo)記的大腸桿菌E。coli O157∶H7的多克隆抗體(PAb)作為二抗，通過三明治方法用雙通道表面等離子體共振(SPR)傳感器對(duì)E。coli O157∶H7進(jìn)行檢測(cè)。SPR直接法檢出限為103cfu/ml，線性范圍為103cfu/ml——109cfu/ml;金納米粒子增強(qiáng)三明治法的檢出限為10cfu/ml，線性范圍為10cfu/ml——1010cfu/ml，靈敏度提高100倍，檢測(cè)范圍更寬，檢測(cè)時(shí)間縮短，選擇性和重現(xiàn)性較好。此技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、價(jià)廉、樣品所需量少等優(yōu)點(diǎn)，適合現(xiàn)場(chǎng)篩選，在飼料檢測(cè)中有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。

　　2 飼料中有害微生物快速檢測(cè)設(shè)備

　　目前，生物學(xué)領(lǐng)域的專家通過對(duì)微生物快速檢測(cè)方面深入的研究，開發(fā)了一系列技術(shù)，有ATP熒光儀、多功能微生物熒光檢測(cè)儀、微生物實(shí)時(shí)光電檢測(cè)系統(tǒng)、紙片法。這些用于食品中有害微生物的快速檢測(cè)技術(shù)，未來同樣可以在飼料中應(yīng)用，這些方法的應(yīng)用將為飼料安全提供有力的保障，同時(shí)可以促進(jìn)我國(guó)飼料工業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。下面重點(diǎn)介紹常用的兩種有害微生物快速檢測(cè)設(shè)備。

　　2.1 RVLM 型微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)

　　由德國(guó)皇家生物科技公司生產(chǎn)的高性能便攜式微生物檢測(cè)儀將多種檢驗(yàn)方法的優(yōu)點(diǎn)集合應(yīng)用，如培養(yǎng)皿法、酶法(β——葡萄糖苷酸酶分析)、免疫法(抗原搜尋)、基因法(基因搜尋)，具有便捷、操作簡(jiǎn)單、檢驗(yàn)迅速、高靈敏性、高特異性、消耗成本低、定性半定量測(cè)量等諸多優(yōu)點(diǎn)。

　　2.1.1 快速檢測(cè)對(duì)象

　　活菌總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、腸道桿菌科、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、李斯特菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌、霉菌(曲霉屬真菌、曲霉菌)、酵母菌、軍團(tuán)菌等，可以定量檢測(cè)。

　　2.1.2 快速檢測(cè)產(chǎn)品特點(diǎn)

　　應(yīng)用范圍廣：應(yīng)用于食品、飼料、藥品、水質(zhì)、空氣微生物檢測(cè)等眾多領(lǐng)域，可檢測(cè)固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)及膏狀、漿狀等多種樣本。

　　使用方便：一套便攜系統(tǒng)即可完成采樣、實(shí)驗(yàn)、后處理等工作，無需配備多種檢測(cè)儀器。

　　操作簡(jiǎn)單：檢測(cè)樣本只需1ml或1g，且無需前處理，只需3個(gè)步驟就可完成操作。

　　高靈敏度：可檢測(cè)到數(shù)量級(jí)為1cfu的目標(biāo)微生物，滿足國(guó)內(nèi)國(guó)際微生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

　　高特異性：特異性高達(dá)99.999%，杜絕非目標(biāo)微生物造成的實(shí)驗(yàn)干擾。

　　準(zhǔn)確度高：可100%定量分析。

　　檢測(cè)數(shù)量：8個(gè)插槽可同時(shí)提供8項(xiàng)不同實(shí)驗(yàn)，13類不同標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)環(huán)境。

　　快速檢測(cè)：最快10min即可得到檢測(cè)結(jié)果，可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

　　高智能化：能夠自動(dòng)控制孵育溫度和孵育時(shí)間，并可自動(dòng)生成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

　　全自動(dòng)化：獨(dú)立、持續(xù)地檢測(cè)并記錄瓶中的微生物數(shù)量(cfu)。

　　在歐洲的實(shí)驗(yàn)室中，80%——90%的微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)采用的儀器是RVLM 型微生物檢測(cè)系統(tǒng)，其超高的靈敏度可以滿足歐盟及國(guó)內(nèi)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。RVLM型微生物快速檢測(cè)是目前業(yè)內(nèi)最高端的智能優(yōu)質(zhì)微生物檢測(cè)儀。

　　2.2 ChemScan RDI微生物快速檢測(cè)儀

　　ChemScan AES Chemunex公司將激光掃描合成成像技術(shù)與活細(xì)胞熒光酶標(biāo)記相結(jié)合，研制成功ChemScan RDI微生物快速檢測(cè)儀。該儀器可在1.5h內(nèi)對(duì)可過濾樣品中的微生物及原生蟲進(jìn)行快速計(jì)數(shù)，適于食品、飼料、化妝品及藥品行業(yè)。其特點(diǎn)：只檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)，激光對(duì)整張濾膜掃描后自動(dòng)讀數(shù)，速度極快，無需增菌，可在90min——100min內(nèi)出結(jié)果;可選配熒光顯微鏡與儀器連接，自動(dòng)定位對(duì)可疑微生物進(jìn)行確認(rèn)觀察。靈敏度：可檢測(cè)出1個(gè)微生物或原生蟲;檢測(cè)范圍：1個(gè)——5000個(gè)細(xì)胞。